HÂMARA MILANEZE DE SOUZA ZANIBONI

Título da Tese: Beneficios da B glucana para saúde intestinal e biossíntese de 1-3 B glucanases fungicas

 Orientadora: Profa. Dra. Graciette Matioli

Data da Defesa:10/12/2021

RESUMO GERAL

 INTRODUÇÃO. As β-glucanas são polímeros de açúcar constituídos de várias unidades monossacarídicas, diferindo-se pelas ligações glicosídicas que as unem. Nas indústrias alimentícias são utilizadas como espessantes, gelificante, texturizante e estabilizantes, contudo, podem apresentar baixa solubilidade em água e elevada viscosidade, dificultando sua aplicação. Também podem ser utilizadas na saúde humana e animal quando consideradas suas propriedades bioativas. Entretanto as β-glucanas podem apresentar baixa solubilidade em água e elevada viscosidade, dificultando sua aplicação industrial. Para solucionar esses problemas a hidrolise enzimática pode ser utilizada para auxiliar na obtenção de oligossacarídeos bioativos e proporcionar aplicações tecnológicas e biológicas. Desta forma, as β-1,3-glucanases sintetizada por fungos filamentosos possuem amplas aplicabilidades nas indústrias alimentícia, química e farmacêutica, entretanto, sua obtenção pode ser onerosa, especialmente devido substratos utilizados para induzir sua síntese. A produção enzimática pode ser realizada com células microbianas libres ou imobilizadas. Portanto, a técnica de imobilização de microrganismos por adesão passiva em superfícies, como em esponja naturais e sintéticas, tem grande potencial para aplicação industrial e pode ser usada na produção das β-1,3-glucanases. Este processo apresenta diversas vantagens sobre o método convencional com células livres, como a capacidade de utilizar os microrganismos em lotes repetitivos com fácil recuperação das células do meio de fermentação e redução do risco de contaminação. OBJETIVOS. O objetivo deste trabalho foi ressaltar os benefícios das β-glucanas bioativas, e produzir β-1,3-glucanase por T. harzianum Rifai, utilizando células livres e imobilizadas em esponjas sintética e vegetal, empregando diferentes substratos indutores que pudessem proporcionar melhor custo-benefício para a produção industrial da enzima. MATERIAL E METODOS. Foi feito um estudo de revisão sobre as β-glucanas e seus benefícios, com o objetivo de caracterizá-las e discorrer sobre seu potencial de atuação na saúde intestinal como polímero bioativo de ação prebiótica e imunomoduladora. Juntamente, foi realizado a síntese da enzima β-1,3-glucanase pelo fungo T. harzianum Rifai. Os substratos específicos estudados foram: curdlana, succinoglucana, amido de milho, amido de mandioca, biomassa fúngica e lactose. Os substratos foram avaliados quanto à produção de β-glucanases na presença do fungo T. harzianum Rifai e da levedura A. pullulan 1WA1, por meio da observação de halo de hidrolise em placa de Petri (zimograma). Após triagem dos substratos pela técnica qualitativa de zimograma, foram realizados ensaios de produção enzimática. A produção de β-1,3-glucanases foi estudada por meio do cultivo de T. harzianum Rifai utilizando células livres e imobilizadas em esponja sintética por meio de processos em lotes repetitivos. Para a imobilização microbiana foram utilizadas matrizes natural e sintética, respectivamente, bucha de Luffa cylindricae esponja sintética de poliuretano. As matrizes foram preparadas em forma de discos, cada um com aproximadamente 25 mm de diâmetro e espessura. Também foram realizados ensaios para síntese de β-1,3-glucanases com diferentes concentrações de amido de milho e amido de mandioca (0,15%; 0,5%; 1,0%; 3,0% e 5,0%), utilizando somente células livres. A atividade da β-1,3-glucanases foi determinada pela quantificação dos açúcares redutores liberados da hidrolise do substrato laminarina, de acordo com o método do cuproarsenato descrito por Somogyi e Nelson. A unidade de atividade de β-1,3-glucanases foi definida como o número de μmoL de açúcares redutores liberados por minuto por mL de extrato enzimático nas condições de ensaio. Os resultados da síntese de β-1,3-glucanases foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey, considerando o nível de significância de 5% (p ≤ 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO. O método de zimograma, o qual é uma técnica qualitativa, de baixo custo e rápida, se mostrou eficiente para triagem de substratos indutores de β-glucanases frente a espécies de fungos filamentosos. Todos os substratos avaliados apresentaram resultado positivo para o método. Foi possível realizar imobilização do T. harzianum Rifai em ambas esponjas sintética e natural. Entretanto, após exposição da esponja natural (L. cylindrica) ao fungo em lotes repetitivos de produção da β-1,3-glucanases, iniciou um processo de degradação do suporte natural, impedindo sua utilização. A degradação do suporte natural foi relacionada ao potencial de síntese de xilanase e celulase pelo T. harzianum. Quanto aos substratos testados, todos resultaram em síntese de β-1,3-glucanase, incluindo a succinoglucana, proposto de forma inovadora neste estudo. A biomassa fúngica resultou no melhor substrato indutor em condições de células livres e imobilizadas, com uma produção de β-1,3-glucanases de 0,73 U e 0,80 U de β-1,3-glucanases. O bom desempenho da biomassa fúngica como substrato indutor já era esperado, uma vez que é conhecido na literatura que as espécies de Trichoderma sintetizam uma maior quantidade de β-glucanases extracelulares quando cultivado em um meio que contenha parede celular fúngica. O amido de milho conseguiu manter a produção de β-1,3-glucanases até o quarto lote avaliado, mostrando ser um substrato bastante interessante, visto que atualmente é o mais barato e acessível no mercado dentre os avaliados nesta pesquisa. A síntese de β-1,3-glucanase utilizando células imobilizadas, no primeiro lote, em relação as células livres, apresentou um acréscimo na produção de β-1,3-glucanases para os meios indutores biomassa fúngica, lactose e succinoglucana com e sem glicose, que atingiram uma concentração enzimática cerca de 8,74%, 47,80%, 78,10% e 46,90% superior, respectivamente. Os substratos amido de milho e mandioca mostraram promissores na produção de β-1,3-glucanase. O amido de milho apresentou melhor resultado neste ensaio e, para os dois substratos estudados, ocorreu o aumento da produção enzimática frente o acréscimo da concentração até 1,0% de substrato, sendo obtido 0,51 U e 0,46 U para amido de milho e amido de mandioca, respectivamente. A partir de 3% de substrato ocorreu diminuição da produção de β-1,3-glucanases para os dois substratos. Não foi observado diferença significativa entre o amido de milho e de mandioca quando utilizada as concentrações de 0,5% e 1% de substrato. Semelhanças na produção entre os substratos deve ser considerada um fator relevante e positivo, tendo em vista a possibilidade de substituição da matéria prima pela indústria frente a variação de preços, devido a sazonalidade das culturas agrícolas. CONCLUSÃO. É possível utilizar a técnica de zimograma para triagem de substratos indutores de β-1,3-glucanases. A biomassa fúngica resultou em boa produção enzimática, contudo, sua aquisição é restrita. As fontes de amido se mostraram promissoras para produção enzimática pelo T. harzianum, sendo de fácil aquisição industrial e de baixo custo. A succinoglucana é passível de ser utilizada como substrato indutor na produção de β-1,3-glucanases fúngica. O uso de células livres e imobilizadas permitiram o reaproveitamento do microrganismo, possibilitando o uso em lotes repetitivos. Portanto, o uso das β-1,3- glucanases possibilita o melhor aproveitamento industrial das β-glucanas com potencial bioativo.

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