PAULA GIMENEZ MILANI FERNANDES
Título da Tese: OBTENÇÃO DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE FOLHAS DE UMA NOVA VARIEDADE DE STEVIA REBAUDIANA, FORTICAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIDIABÉTICA DE WHEY PROTEIN ISOLADO COM FRAÇÃO DE STEVIA RICA EM COMPOSTOS FENÓLICOS.
Orientador: Prof. Dr. Silvio Claudio da Costa
Data da Defesa: 27/04/2017
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO: Stevia rebaudiana (Bert.). Bertoni é mundialmente conhecida e explorada por apresentar naturalmente em suas folhas, glicosídeos de esteviol de alto poder edulcorante. Entre estes compostos, os mais proeminentes são o esteviosídeo e o rebaudiosídeo A, ambos estudados nas últimas décadas também por suas propriedades antidiabéticas. Entretanto, além dos glicosídeos de esteviol, as folhas de estévia foram descritas como fonte de compostos fenólicos e flavonoides. Muitos esforços têm sido feitos para isolar e caracterizar frações ricas em compostos fenólicos de folhas de estévia, de uma nova variedade seminal e de elite, Stevia UEM-13, com o objetivo de avaliar seu potencial de uso como fonte multifuncional de compostos fenólicos. Este estudo relaciona a obtenção de uma fração de Stevia com alto conteúdo de compostos fenólicos, que teve sua composição centesimal determinada e também, seus principais fenólicos e flavonoides presentes foram identificados, por meio da análise LCMS. A fração com potencial para alimentos fortificantes foi adicionada em um isolado proteico obtido a partir de soro de leite (WPI), e o suplemento desenvolvido foi testado quanto aos seus efeitos antioxidantes e antidiabéticos. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi determinar a composição e o potencial antioxidante de folhas de uma nova seminal variedade de Stevia rebaudiana (Stevia UEM-13), determinar os teores de glicosídeos de esteviol, compostos fenólicos, flavonoides e de capacidade antioxidantes de diferentes extratos e frações obtidos a partir das folhas de Stevia UEM-13; e avaliar o potencial da fração com alta capacidade antioxidante, obtida pelo fracionamento em acetato de etila, como fortificadora ou enriquecedora da atividade antioxidante e antidiabética de isolado proteico do soro do leite (Whey protein) produzido por processos de separação por membranas. MATERIAIS E MÉTODOS: As plantas de Stevia rebaudiana da variedade seminal UEM 13 cultivadas em NEPRON (UEM) foram coletadas no de estágio máximo crescimento vegetativo. Estes arbustos foram previamente secos em estufa a 60°C e as folhas foram subsequentemente separadas dos caules e ramos, colocadas em sacos de polietileno e armazenadas a -18°C antes do desenvolvimento dos diferentes extratos. Os reagentes químicos foram adquiridos a Sigma-Aldrich. Diferentes extratos e frações foram obtidos a partir dessas folhas e foram analisados quanto aos teores de glicosídeos totais (CLAE), compostos fenólicos (Folin), flavonoides totais e capacidade antioxidante (DPPH). O Extrato aquoso das folhas de Stevia UEM 13 foi obtido por meio de uma extração aquosa de uma amostra de 2,0 g de folhas, adicionadas de 250 ml de água destiladas e aquecidas a 100 ºC. Amostras das folhas dessa variedade foram ainda usadas para extrações com os solventes etanol absoluto e metanol, os quais foram utilizados para extração em aparelho Sohxlet e maceração (somente etanol absoluto). O extrato metanólico, por apresentar maior rendimento de extração dos compostos de interesse foi fracionado com hexano, clorofórmio, acetato de etila e isobutanol e as frações obtidas foram analisadas. A fração de acetato de etila (ASF), por apresentar-se livre de glicosídeos e com alta capacidade antioxidante foi analisada em LCMS/MS, os compostos fenólicos e flavonoides foram identificados, e além disso sua composição proximal foi determinada. ASF foi usada como fração fortificadora de um isolado proteico do soro do leite (ASF foi adicionada ao WPI na concentração de 0,2%). A obtenção de WPI foi feita de acordo com Milani et al. (2016) com modificações. O soro foi concentrado em sistema de ultrafiltração (UF), diafiltração (DF) e (NF). Uma amostra deste concentrado foi seca em secador por pulverização. Os processos UF e DF foram feitos em um sistema com membranas filtrantes de polietersulfona (corte de 10 kD), marca Koch, em configuração espiral, com área de 50 cm2 . Foram realizados 12 ciclos de diafiltração. A nanofiltração foi realizada em sistema de osmose reversa, composta por duas membranas de poliamida com massa molecular de corte 180D (Koch) e 500D (Millipore), ambas em configuração espiral, com área de 50 cm2 cada. A secagem do WPI foi realizada em atomizador secador spray. Um teste de citotoxicidade também foi realizado (teste MTT). Para testar a atividade antidiabética foram estabelecidos 4 grupos experimentais que receberam os seguintes suplementos diariamente: 1) WPI - isolado de proteína de soro de leite (100 mg/kg); 2) ASF - fração de estévia (0,2 mg/kg); 3) WPI + ASF - proteína isolada de soro de leite fortificada com 0,2% da fração de estévia (100 mg/ kg); 4) DC- diabético controle; recebeu apenas água e ração. Um quinto grupo controle (C), não diabético e não suplementado também foi estabelecido. A suplementação oral foi realizada diariamente, às 08:00 horas, por um período de 30 dias, por gavagem esofágica. Semanalmente foram avaliados glicemia de jejum e no estado alimentado, e peso corporal. Após os tratamentos foram avaliadas as taxas plasmáticas e séricas de glicose, colesterol total, colesterol HDL, triglicérides, frutosamina, AST e ALT. A capacidade antioxidante total também foi avaliada no plasma de todos os grupos de animais após o tratamento. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Entre os principais resultados das diferentes extrações realizadas a partir das folhas de Stevia UEM-13, podemos destacar que o extrato metanólico apresentou maior rendimento de extração dos compostos de interesse quando comparado ao extrato etanólico e por isso foi fracionado com diferentes solventes. A fração isobotanólica mostrou maior teor de glicosídeos (65,3%). A fração obtida em acetato de etila apresentou o maior conteúdo de compostos fenólicos e flavonoides (524.20 mg equivalente de ácido gálico/g; 380.62 µg equivalente de quercetina/g, respectivamente), e também alta capacidade antioxidante e apresentou-se com baixo teor de glicosídeos. Os principais compostos identificados por LCMS/MS foram o ácido cafeico, quercetina-3-o-glicosídeo, cianidina-3- glicosídeo, kaempferol, quercetina, apigenina, ácido rozmarínico, ácido cloriogênico e ácido dicafeoilquínico. A fração de estevia em acetato de etila (ASF) foi utilizada como fonte multifuncional de compostos fenólicos na fortificação do isolado de proteínas de soro de leite (WPI) obtido por processos de separação de membranas. WPI fortificado com 0,2% de ASF teve sua atividade antioxidante aumentada em 80%. O WPI fortificado com ASF apresentou efeitos antidiabéticos mais pronunciados em relação ao WPI não fortificado, principalmente no controle glicêmico de animais diabéticos induzidos por estreptozotocina. Importantes efeitos antioxidantes in vitro e in vivo foram mostrados pela fração de Stevia ASF, o que contribuiu de forma expressiva para fortificar o WPI. Este estudo pioneiro mostra que a ASF pode ser usada para enriquecer as propriedades antioxidantes e antidiabéticas do WPI. CONCLUSÕES: A avaliação da extração e do fracionamento desta planta utilizando diferentes solventes e metodologias, resultou em extratos de diferentes capacidades antioxidantes, que podem ser utilizados para enriquecer a literatura e contribuir para sua aplicação em alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos. Uma dieta rica em antioxidantes pode contribuir significativamente para prevenir doenças degenerativas, doenças cardiovasculares e metabólicas, como o diabetes mellitus. Assim, os alimentos naturais e industrializados enriquecidos com flavonoides e compostos fenólicos contribuem para a redução dessas doenças. O presente estudo mostrou que os extratos de etanol, metanol e acetato de etilo de folhas de Stevia rebaudiana (Stevia UEM-13) possuem um grande potencial antioxidante e podem ser usados como possíveis aditivos para melhorar a funcionalidade de alimentos e bebidas. Por meio dos processos de separação das membranas, foi possível obter a partir do soro do leite, um isolado (WPI) com uma concentração importante de proteínas. A fração Stevia, ASF, obtida com 3,82% de rendimento, exibiu compostos fenólicos como principais constituintes. Os principais ácidos fenólicos e flavonoides identificados na ASF estão de acordo com a literatura. A ASF na concentração de 0,2% promoveu aumento de 80% na atividade antioxidante WPI. Os testes fisiológicos mostraram que os três suplementos (ASF, WPI e WPI + ASF) foram benéficos para melhorar o controle metabólico de ratos diabéticos. O WPI fortificado com ASF foi o suplemento alimentar com maior funcionalidade, mostrando que a ASF tem potencial para ser utilizada como fortificador da atividade antioxidante e antidiabética de alimentos como o WPI, e possivelmente enriquecendo outros alimentos ou suplementos. Palavras-chaves: Isolado protéico de soro; fração antioxidante de Stevia rebaudiana; compostos fenólicos; flavonoides; diabetes mellitus.
Artigos Publicados Vinculados a Tese:
DOI 10.1007/s13197-017-2638-0 https://doi.org/10.1590/0001-3765201720170174 https://doi.org/10.1007/s13197-020-04799-3
Capítulos de livros publicados vinculados a tese:
10.22533/at.ed.25019031210